海洋鱼绿鳍马面鲀基因组组装

研究背景

占比地球容量71%的海洋中蕴藏着丰富的生物资源，而海洋生物体内多糖和蛋白含量较高，以及部分海洋生物极易死亡腐败从而引起DNA的降解，给高纯度、完整的基因组DNA的获取带来了极大的困难。而海洋生物通常与陆生动植物相比更为复杂，组装拼接的难度更大。

本次研究利用Nanopore测序技术长读长、易组装、跨越重复基因组区域等优势突破了这些瓶颈，完成了海洋鱼类超高质量的基因组组装。

研究方法与结果

研究中使用104X Nanopore测序数据进行基因组组装，通过Canu、WTDBG等多款软件分别进行组装，选取最优的组装结果（主要从基因组大小，contig N50，组装完整性，组装准确性等方面评估）进行后续研究优化。

研究者最终使用WTDBG软件组的基因组版本结合Hi-C技术的进一步优化，最终组装完成474.31 Mb基因组，并将99.44%的基因组挂载至20条染色体上， ContigN50提升至22.46 Mb，且最长的Contig达到32.32 Mb！

Contig N50是衡量基因组组装质量好坏的一个重要指标，一定程度上来说，ContigN50值越高表示组装的质量越好。与已有鲀形目基因组比较，绿鳍马面鲀基因组组装的ContigN50超过了同样使用三代测序进行组装的黄鳍东方鲀（Takifugu flavidus）的5倍，更是超过了翻车鱼（Mola Mola）的1000倍！

表1 鲀形目基因组比较

而与近年的一些鱼类基因组ContigN50相比，绿鳍马面鲀基因组组装的连续性同样也是表现超群。表中不难发现，近年来鱼类基因组ContigN50水平基本在Kb与Mb之间徘徊，而本次使用Nanopore组装的绿鳍马面鲀直接上升了一个数量级，完成了连续性超强的优质基因组。

表2 已发表的鱼类基因组

基因组完整性评估

研究者分别用Racon及Pilon进行两轮及三轮纠错来对WTDBG的组装的基因组进行polish，并对纠错前后基因组的完整性进行了多个方面的评估。

二代reads比对分析

利用bwa软件将二代数据与参考基因组进行比对。结果显示，二代reads双端比对效率为97.41%，表明三代组装基因组完整性较好。

核心基因完整性评估

CEGMA v2.5数据库包含了真核生物458个保守的核心基因。使用CEGMA v2.5来评估最终基因组组装的完整性。在最终版的基因组中，通过序列相似性（Identity > 70%）比对，共找到了458个核心基因中的442个（96.51%）。而在CEGMA v2.5所包含的更加保守的248个序列中，91.13%可以在组装的基因组找到。

BUSCO评估

BUSCO v2中actinopterygii数据库包含了真核生物中的4584个保守的核心基因。我们使用BUSCO v2.0软件来评估基因组组装的完整性。在我们组装的基因中，共找到4,324个完整的BUSCO基因，其中单拷贝的4,213个，多拷贝的有111个；不完整的BUSCO基因有62个；未找到的有198个，BUSCO评估基因组完整度为94.33%（Complete BUSCOs/Total BUSCOs）。

评估结果均显示完整度在94%以上，说明了基因组的整体组装质量非常优异，将对后续的下游分析极为有利，具有无限的开发潜力。

结论

本次案例中的海洋经济鱼——绿鳍马面鲀通过Nanopore平台进行了超长读长的基因组测序，使海洋生物组装指标（contig N50）超越22 Mb！成为了目前为止我们所知的海洋动物N50最高的基因组！同时评估结果也表明，组装的准确度与完整性也非常高。